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质粒DNA纯化步骤,您还不知道吗

浏览次数:40发布日期:2020-12-01
   质粒DNA纯化步骤,您还不知道吗
  DNA纯化和提取是法医DNA物证鉴定的关键技术之一。质粒是一种小环DNA。在基因工程中,质粒常被用作载体,将靶基因转移到受体细胞中。虽然近年来发展了许多更先进的基因转移载体(如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体等),但质粒载体由于其制备简单、在各种细胞中的高效性,仍被大多数实验室所使用。
  大量提取的质粒DNA需要进一步纯化,常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。所有的纯化方法通常都使用两种性质,即相对较小的质粒DNA和共价闭环。例如,用氯化铯进行质粒和染色体DNA的梯度平衡离心,取决于溴化乙锭与线性和闭环DNA分子之间的结合量。
  质粒DNA纯化步骤如下:
  1、用无菌牙签选择平板上的单个菌落,接种于含有相应抗生素的3ml-LB培养基中,在37℃下于220rpm振动台上培养过夜。
  2、将1.5mL过夜培养的菌液转移至Eppendorf离心管内,12000rpm离心30秒,弃上清。
  3、加入100ul预冷的溶液Ⅰ,充分振荡以悬浮沉淀,冰浴5分钟。
  4、加入200ul新鲜配制的溶液Ⅱ,轻轻颠倒5次混匀,使溶液澄清,冰浴放置5分钟。
  5、加入150ul预冷的溶液III,轻微振荡均匀,冰浴5分钟。
  6、12000rpm离心10分钟,转移上清至另一个灭菌Eppendorf管中。
  7、加入等体积录仿:异戊醇(体积比24:1),混匀,以12000rpm离心10分钟,取上层水相至另一个灭菌的Eppendorf试管中。注意,不采用低相溶液。
  8、加入两倍体积的冰乙醇,混匀,在-20℃沉淀15分钟,以12000rpm离心10分钟收集沉淀。
  9、加70%乙醇1ml洗涤一次,12000rpm离心10分钟,弃去,室温干燥,加50ul Te溶解核酸,备用。
  好了,以上便是关于质粒DNA纯化的相关内容介绍了。
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